Uso e precaucións do tubo centrífugo de ultrafiltración
1) Escolla un tubo de ultrafiltración axeitado.Teña en conta que as membranas UF difiren no seu nivel de tolerancia a varios produtos químicos.Normalmente, os tubos de ultrafiltración cun límite de peso molecular de 10 kDa pódense seleccionar cun límite de peso molecular que non debe ser superior a 1/3 do peso molecular da proteína de interese, como 35 kDa.Se o peso molecular da proteína de interese é duns 10 kd, pódese utilizar un tubo de ultrafiltración cun límite de peso molecular de 3 kd.
(2) A ultrafiltración, recén comprada, é seca, con auga ultrapura engadida antes do uso e auga completamente pasada pola membrana, o baño de xeo ou o frigorífico previamente arrefriado durante uns minutos.A continuación bótase a auga, é dicir, a proteína líquida, e a cantidade que se engade, o que non sexa máis que a liña branca na parte superior do tubo.A operación é lixeira e o tubo de ultrafiltración debe ser preenfriado en xeo antes de engadir a solución proteica.
3) Tanto a masa como o centro de gravidade debían alcanzar o equilibrio.Teña en conta que a velocidade de rotación e a aceleración non son moi rápidas, se non, danando directamente a membrana de ultrafiltración.Iniciouse a ultrafiltración centrífuga (centrífuga preenfriada a 4 graos).Despois de que as RPM de diferentes centrífugas fosen convertidas en g, era diferente.A aceleración da centrífuga axustouse ao mínimo, reducindo a presión sobre a membrana.Teña en conta que asegúrese de deixar a centrífuga despois de que a centrífuga alcanzou a súa velocidade de destino ou, se tes un problema, non podes manexalo por primeira vez.A orientación da membrana ao fuso axustouse segundo as instrucións (o caso da centrífuga angular é de membrana a eixe perpendicular).No uso práctico, a velocidade de rotación xeral é inferior á das instrucións, polo que se pode prolongar a vida útil do tubo de centrífuga.
3) Tanto a masa como o centro de gravidade debían alcanzar o equilibrio.Teña en conta que a velocidade de rotación e a aceleración non son moi rápidas, se non, danando directamente a membrana de ultrafiltración.Iniciouse a ultrafiltración centrífuga (centrífuga preenfriada a 4 graos).Despois de que as RPM de diferentes centrífugas fosen convertidas en g, era diferente.A aceleración da centrífuga axustouse ao mínimo, reducindo a presión sobre a membrana.Teña en conta que asegúrese de deixar a centrífuga despois de que a centrífuga alcanzou a súa velocidade de destino ou, se tes un problema, non podes manexalo por primeira vez.A orientación da membrana ao fuso axustouse segundo as instrucións (o caso da centrífuga angular é de membrana a eixe perpendicular).No uso práctico, a velocidade de rotación xeral é inferior á das instrucións, polo que se pode prolongar a vida útil do tubo de centrífuga.
(4) Cando se concentre ata o 1 ml restante, tómase 50 ul de solución tampón, engade 10 ul de fluxo e vexa se hai algunha cor azul, como xuízo se o tubo de ultrafiltración lle falta proteína.Se o tubo ten fugas, volva verter a capa superior e o fluxo nun novo tubo para comezar a ultrafiltración.Para determinar con precisión se perderon tubos, centrifugue durante 10 min con 5 mg ml de BSA antes do fluxo, funcionando con cola proteica ou ensaio de Bradford bruto, e continúe engadindo a solución de proteína concentrada restante (que funciona sobre xeo e evita que as proteínas se quenten) ata todo o concentrado foi engadido.Ten coidado durante a centrifugación se se produce a precipitación de proteínas, o que provoca o peche do tubo.Se se produce precipitación, determine se a causa específica da precipitación é unha concentración excesiva de proteínas ou un tampón inadecuado;O primeiro pódese resolver mediante a ultrafiltración de varios tubos de ultrafiltración simultaneamente, diminuíndo a concentración, e o segundo intercambiando diferentes solucións tampón ata que non se produza a precipitación da proteína.
(4) Cando se concentre ata o 1 ml restante, tómase 50 ul de solución tampón, engade 10 ul de fluxo e vexa se hai algunha cor azul, como xuízo se o tubo de ultrafiltración lle falta proteína.Se o tubo ten fugas, volva verter a capa superior e o fluxo nun novo tubo para comezar a ultrafiltración.Para determinar con precisión se perderon tubos, centrifugue durante 10 min con 5 mg ml de BSA antes do fluxo, funcionando con cola proteica ou ensaio de Bradford bruto, e continúe engadindo a solución de proteína concentrada restante (que funciona sobre xeo e evita que as proteínas se quenten) ata todo o concentrado foi engadido.Ten coidado durante a centrifugación se se produce a precipitación de proteínas, o que provoca o peche do tubo.Se se produce precipitación, determine se a causa específica da precipitación é unha concentración excesiva de proteínas ou un tampón inadecuado;O primeiro pódese resolver mediante a ultrafiltración de varios tubos de ultrafiltración simultaneamente, diminuíndo a concentración, e o segundo intercambiando diferentes solucións tampón ata que non se produza a precipitación da proteína.
(5) Os primeiros pasos utilízanse para concentrar a proteína e, se se quere cambiar o tampón, engade suavemente un novo tampón (ultrafiltración a través dunha membrana de ultrafiltración de 0,22 um) a aproximadamente 1 ml de proteína total e reconcéntreo a aproximadamente 1 ml durante tres veces consecutivas, co volume final concentrado final dependendo da concentración de proteína desexada, xeralmente non máis de 500 ul, pero tamén ata 200 ul.Consiga 1000 × ou máis en tres ocasións, esencialmente o mesmo cambio de tampón, calculado por polo menos 10 × máis ou menos enriquecemento de volume cada vez.
(5) Os primeiros pasos utilízanse para concentrar a proteína e, se se quere cambiar o tampón, engade suavemente un novo tampón (ultrafiltración a través dunha membrana de ultrafiltración de 0,22 um) a aproximadamente 1 ml de proteína total e reconcéntreo a aproximadamente 1 ml durante tres veces consecutivas, co volume final concentrado final dependendo da concentración de proteína desexada, xeralmente non máis de 500 ul, pero tamén ata 200 ul.Consiga 1000 × ou máis en tres ocasións, esencialmente o mesmo cambio de tampón, calculado por polo menos 10 × máis ou menos enriquecemento de volume cada vez.
Hora de publicación: 09-nov-2022