PCR, é a reacción en cadea da polimerase, que se refire á adición de dNTP, Mg2+, factores de alongamento e factores de mellora da amplificación ao sistema baixo a catálise da ADN polimerase, utilizando o ADN proxenitor como molde e cebadores específicos como punto de partida de extensión , A través dos pasos de desnaturalización, recocido, extensión, etc., o proceso de replicación in vitro do ADN da cadea filla complementaria ao ADN modelo da cadea nai pode amplificar de forma rápida e específica calquera ADN diana in vitro.
1. PCR de inicio en quente
O tempo de inicio da amplificación na PCR convencional non é poñer a máquina de PCR na máquina de PCR, e entón o programa comeza a amplificarse.Cando se completa a configuración do sistema, comeza a amplificación, o que pode provocar unha amplificación non específica, e a PCR de inicio en quente pode resolver este problema.
Que é a PCR de inicio en quente?Despois de preparar o sistema de reacción, o modificador enzimático liberase a alta temperatura (xeralmente superior a 90 °C) durante a fase de quecemento inicial da reacción ou etapa de "inicio en quente", de xeito que se activa a ADN polimerase.O tempo e a temperatura exactos de activación dependen da natureza da ADN polimerase e do modificador de arranque en quente.Este método usa principalmente modificadores como anticorpos, ligandos de afinidade ou modificadores químicos para inhibir a actividade da ADN polimerase.Dado que a actividade da ADN polimerase inhibe a temperatura ambiente, a tecnoloxía de inicio en quente proporciona unha gran comodidade para preparar múltiples sistemas de reaccións de PCR a temperatura ambiente sen sacrificar a especificidade das reaccións de PCR.
2. RT-PCR
A RT-PCR (Reverse transcription PCR) é unha técnica experimental para a transcrición inversa de ARNm a ADNc e utilizala como molde para a amplificación.O procedemento experimental consiste primeiro en extraer o ARN total en tecidos ou células, utilizar Oligo (dT) como cebador, utilizar a transcriptase inversa para sintetizar ADNc e, a continuación, utilizar o ADNc como molde para a amplificación da PCR para obter o xene diana ou detectar a expresión xénica.
3. PCR cuantitativa fluorescente
PCR cuantitativa fluorescente (PCR cuantitativa en tempo real,RT-qPCR) refírese ao método de engadir grupos fluorescentes ao sistema de reacción de PCR, utilizando a acumulación de sinais fluorescentes para supervisar todo o proceso de PCR en tempo real e, finalmente, utilizar a curva estándar para analizar cuantitativamente o modelo.Os métodos de qPCR de uso común inclúen SYBR Green I e TaqMan.
4. PCR anidada
A PCR anidada refírese ao uso de dous conxuntos de cebadores de PCR para dúas quendas de amplificación por PCR, e o produto de amplificación da segunda rolda é o fragmento do xene diana.
Se unha falta de coincidencia do primeiro par de cebadores (cebadores externos) fai que un produto inespecífico sexa amplificado, a posibilidade de que a mesma rexión inespecífica sexa recoñecida polo segundo par de cebadores e continúe amplificando é moi pequena, polo que o amplificación polo segundo par de cebadores, mellorouse a especificidade da PCR.Unha vantaxe de realizar dúas roldas de PCR é que axuda a amplificar suficiente produto a partir de ADN inicial limitado.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR é un método para mellorar a especificidade da reacción de PCR axustando os parámetros do ciclo de PCR.
Na PCR de contacto, a temperatura de recocido para os primeiros ciclos establécese uns graos por riba da temperatura máxima de recocido (Tm) dos cebadores.A temperatura de recocido máis alta pode reducir eficazmente a amplificación inespecífica, pero ao mesmo tempo, a temperatura de recocido máis alta agravará a separación dos cebadores e das secuencias diana, o que resultará nun rendemento reducido da PCR.Polo tanto, nos primeiros ciclos, a temperatura de recocido adoita establecerse para diminuír 1 °C por ciclo para aumentar o contido do xene obxectivo no sistema.Cando a temperatura de recocido se baixa ata a temperatura óptima, a temperatura de recocido mantense durante os ciclos restantes.
6. PCR directa
A PCR directa refírese á amplificación do ADN diana directamente da mostra sen necesidade de illamento e purificación de ácidos nucleicos.
Hai dous tipos de PCR directa:
método directo: tome unha pequena cantidade de mostra e engádaa directamente a PCR Master Mix para a identificación por PCR;
método de craqueo: despois de tomar a mostra da mostra, engádea ao lisado, lise para liberar o xenoma, tome unha pequena cantidade de sobrenadante lisado e engádeo a PCR Master Mix, realice a identificación por PCR.Este enfoque simplifica o fluxo de traballo experimental, reduce o tempo práctico e evita a perda de ADN durante os pasos de purificación.
7. SOE PCR
O empalme de xenes mediante a PCR de extensión superposta (SOE PCR) utiliza cebadores con extremos complementarios para facer que os produtos da PCR formen cadeas superpostas, de xeito que na reacción de amplificación posterior, mediante a extensión das cadeas superpostas, diferentes fontes da técnica A na que se superpoñen fragmentos amplificados. e empalmados xuntos.Esta tecnoloxía ten na actualidade dúas direccións de aplicación principais: construción de xenes de fusión;mutación dirixida ao sitio xenético.
8. IPCR
A PCR inversa (IPCR) usa cebadores complementarios inversos para amplificar fragmentos de ADN distintos dos dous cebadores, e amplifica secuencias descoñecidas a ambos os dous lados dun fragmento de ADN coñecido.
O IPCR foi deseñado orixinalmente para determinar a secuencia de rexións adxacentes descoñecidas, e úsase principalmente para estudar secuencias promotoras de xenes;rearranxos cromosómicos oncoxénicos, como a fusión de xenes, a translocación e a transposición;e integración de xenes víricos, tamén se usan habitualmente agora Para a mutaxénese dirixida ao sitio, copie un plásmido coa mutación desexada.
9. dPCR
A PCR dixital (dPCR) é unha técnica para a cuantificación absoluta de moléculas de ácido nucleico.
Actualmente existen tres métodos para a cuantificación de moléculas de ácido nucleico.A fotometría baséase na absorbancia das moléculas de ácido nucleico;A PCR cuantitativa fluorescente en tempo real (PCR en tempo real) baséase no valor Ct, e o valor Ct refírese ao número de ciclo correspondente ao valor de fluorescencia que se pode detectar;A PCR dixital é a tecnoloxía cuantitativa máis recente baseada no método de PCR dunha soa molécula para contar. A cuantificación de ácidos nucleicos é un método cuantitativo absoluto.
Hora de publicación: 13-Xun-2023